外泌體的分離純化、鑒定（如何分離純化、鑒定外泌體）

      外泌體是指包含了復雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)，現(xiàn)今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)， 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其主要來源于細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中 。
所有培養(yǎng)的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。 有關他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的精確分子機制剛剛開始研究。 外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用于微創(chuàng)診斷的開發(fā)。

 
一、分離:
超速離心法:
        超速離心法是外泌體分離最常見的技術之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，約有1/2的研究者會選擇該種方式分離外泌體。該方法由幾個離心步驟組成，可分步去除細胞、細胞碎片和大囊泡，沉淀外泌體（如圖所示）。但該種方法用于血漿和血清等粘性生物液體時效率較低，且重復離心操作有可能對外泌體造成損害，從而降低其質(zhì)量。
 
        如將超速離心配合蔗糖溶液進行梯度密度離心可得到純度更高的外泌體，是公認可以得到最高純度的分離方法。但此法對離心時間非常敏感，一般需要8-30h，產(chǎn)率較低，同樣不適用于血漿和血清等粘性生物液體中外泌體的分離，因此難以廣泛普及。
 
 
聚合物沉淀法:
        第二大主流的外泌體分離技術就是基于聚合物的沉淀法了，最常見的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常將含有聚合物的沉淀溶液與生物體液混合，4℃溫育，低速離心，沉淀外泌體（如圖所示）。目前已有成熟的PEG-base商業(yè)試劑盒，比如圖中的ExoQuick?（System Biosciences）。這類試劑盒使用容易和快速，不需要額外的設備，且隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。沉淀法的主要缺點是分離物中會有少量的聚合物存在。不過大家不用擔心，一般來說這些物質(zhì)不會干擾下游分析，使用商業(yè)試劑盒提取外泌體也受到越來越多雜志的認可。


 
二、鑒定
        外泌體的鑒定是繼分離后又一個困擾研究者的問題。如果大家看過外泌體研究相關的文獻，就肯定對一張圖印象深刻。


 
        不錯，想發(fā)外泌體文章，光找到高效率的分離方法還不夠，要過的第二關就是證明你分離得到的就是外泌體。

鑒定方式不外乎就是下面這三種：1. 形態(tài)學（電鏡）；2. 粒子大?。◤搅７治觯?；3. 標志蛋白（WB）。

綜合來說，透射電鏡可以清楚的看到外泌體的大小、形態(tài)等，屬于鑒定方法中的金標準，其他兩種方式則常常作為輔助使用。
 
三、得到了外泌體之后如何做？
        外泌體攜帶大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特異性的蛋白質(zhì)（如細胞因子、生長因子）等生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細胞通訊、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關。對外泌體驗明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平對其進行檢測和深入分析了。


         由于外泌體中含有較多降解的短RNA片段，測序時會成為背景干擾有效數(shù)據(jù)，通常都建議使用芯片的方法檢測外泌體miRNA。而對于lncRNA來說，大部分在細胞內(nèi)低表達，在外泌體中豐度就更低了，對于低豐度基因，芯片檢測的準確性遠遠大于測序，因此也建議使用基因芯片的方法檢測外泌體lncRNA。

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